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荧光定量PCR 实验步骤（1） 

样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②每样品加入1ml的TRIZOL试剂裂解，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%，江苏荧光定量PCR技术服务，江苏荧光定量PCR技术服务。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，江苏荧光定量PCR技术服务，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用移液器反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 江苏荧光定量PCR技术服务

荧光定量PCR实验步骤：

  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

  两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 上海荧光定量PCR分析服务

为了正确地评估 PCR 效率，至少需要 3 次重复和至少 5 个数量级倍数的模板浓度。图 6 说了建议此精确级别的理由，它证明在 1 个数量级倍数与 5 个数量级倍数范围内测试稀释模板时，获得的斜率或效率可能产生数学偏差。因此，即使检测 ** 有效，由于每个稀释点都存在标准差，检测一个数量级倍数的连续稀释时，可能获得 70 至 170% 的范围。在 5 个数量级倍数范围内做相同数量的稀释点或重复，可能的偏移只有 ±8%。这意味着在 5 个数量级倍数范围内，如果效率为 94%，则该实验的效率范围介于 88% 到 ** 之间。为了准确测定 PCR 反应的效率，必须进行 5 个数量级倍数的连续稀释。-3.3 ±10% 的斜率意味着效率达到 ** ±±10%。PCR 反应效率越低，那么灵敏度越低。

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实时荧光定量PCR在病原微生物检测中的应用

实时荧光定量PCR是通过荧光信号监测目的基因扩增数量的定量PCR技术,具有灵敏度高,检测速度快等优点。实时荧光定量PCR已被应用于乙肝病原微生物、登革热病原微生物、流感病原微生物、水疱口炎病原微生物等病原微生物的快速检测,在病原微生物快速分型、相似病原微生物的鉴别检测、耐药病原微生物突变体检测等临床和公共卫生领域得到广泛应用。狂犬病是危害严重的**共患病,病死率几乎为。实时荧光定量PCR技术已被应用于狂犬病病原微生物和狂犬病相关病原微生物的核酸检测,具有与金标准DFA相当的灵敏度和特异度,同时克服了金标准DFA的某些局限性,如检测速度更快,无需提取脑组织,对唾液、脑脊液等低病原微生物载量样本具有较好的检出效果,具有成为人间狂犬病诊断技术的潜力。灵敏度是传统RT-PCR的200倍以上,交叉污染的风险更低。实时荧光定量PCR也应用于欧洲蝙蝠病原微生物等狂犬病相关病原微生物的检测,可建立多重实时荧光定量PCR在单一检测体系对多种病原微生物进行快速鉴别,对于预防病原微生物性传染病具有重要的公共卫生意义。 上海荧光定量PCR检测服务

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一个评估 PCR 效率的关键参数是 R2，它是说明如何使用一个数值预测另一个数值的相关程度的统计学术语。如果 R2 为 1，那么 Y 值 (Ct) 可以用来准确预测 X 值（图7A）。如果 R2 为 0，那么就不能通过 Y 值预测 X 值（图 7B）。R2 值 >0.99 表示两个数值之间相关的置信度良好。

精确度

标准差（偏差的平方根）是**常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠**均值，则标准差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准差就大。

实际上，足够多重复次数产生的数据**形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限定理来证明，该定理称大量**同分布随机变量的和在无限多时趋向于正态分布。如图 8A 所示，约 68% 的值在平均值的 1 个标准差之内，约 95% 的值在平均值的 2 个标准差之内，约 99.7% 的值在平均值的 3 个标准差之内。 江苏荧光定量PCR技术服务

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