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    定位准确、简便、快速、鲜明，在许多领域中仍占有不可取代的地位。如肾活检、皮肤活检中IgG、IgM、IgA、C3等检测，自身抗体的检测，传染病的快速诊断，单克隆抗体的筛选及鉴定等。随着科学技术地不断发展，免疫荧光组织化学技术已经广泛应用于生命科学的各个领域，放射出更加五彩缤纷的荧光。参考文献（1）AkivoshiKawamura,.（2）王伯沄.免疫荧光组织化学和荧光组织化学技术.第四军医大学科技资料增刊，北京多标记免疫组化检测服务,1974;2:5-30.（3）.（4）WickG,TraillKN,.（5）.（6）蔡文琴,王伯沄主编.实用免疫细胞化学.成都：四川科技出版社1990，P968-977.（7）李成文.现代免疫化学技术.上海:上海科技出版社1992；P97-100.（8）Mahmudi-A3er-s,Lacy-P,Bablit2-B,(1-2):113-119.（9）Magro-C-M,(9):543-552.（10）(4):286-298.（11）GregoniWeber,(1):419-422，北京多标记免疫组化检测服务.（12）SavigeJA,PaspaliansB,SilvestriniR,(ANCA)(18):568-571.（13）BallouB,FisherGW,DengJS，北京多标记免疫组化检测服务,(3):251-257.（14）GruberHJ,HahnCD,KadaG,(5):696-704.（15）SouthweelBR,(5):1140-1151.（16）ArsenievL,PickerdN,GoudevaL,(5):547-559.（17）O'BrjenTE,MetheneyCD,(TIGR)proteinintrabecularmeshworkandschlemm'(6):517.（18）HuangMC。北京多标记免疫组化检测服务

多重荧光免疫组化染色技术

免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，随着免疫zhiliao的崛起，越来越多**微环境种的标志物被发现与疾病zhiliao、进展密切相关，对这些标志物进行同时染色标记、并研究它们之间的共定位、表达量和距离关系成为肿瘤免疫研究的普遍需求。

酪氨信号放大技术原理

类似常规免疫组化的DAB显色法，TSA（Tyramide signal amplification）技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

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    免疫细胞化学技术组织印片·将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷**或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。免疫细胞化学技术细胞培养片(细胞爬片)·贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(**-20C固定10～20min)，再进行免疫染色。–盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。–为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。免疫细胞化学技术细胞涂片·大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：–血液、尿液、脑脊液；–体腔积液；–组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织–悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。免疫细胞化学技术细胞涂片(续)·细胞涂片的方法：–手涂法·将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。·图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。–涂片机涂片法·将细胞样品制成2×105～6/ml细胞悬液，吸取50～100l(1～2×104～5cells)加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。免疫细胞化学技术常用染色方法根据标记物的不同分为免疫荧光法、免疫酶标法、亲和组织化学法。

    使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源比较好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。3、免疫组化和免疫荧光结果分析：见***场试验讲座。案例一DAB染色后切片着色一片黄/背景深背景：奥运会期间我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京购买的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一直用中杉金桥的SP三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会期间我准备做同批实验分不同批次酶免疫组化实验，***批组化实验结果很好，抗体浓度感觉比较合适（SantaCruz公司1：200），等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺利进行，我又从福州迈新顶了一个SP试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又重新从博士德公司买了一小瓶10ml。从第二批实验开始，组化实验结果一直显示强背景着色，特异性染色很难辨别。后来我将标本拿到上海舜田生物去做，做了效果很不错，于是我就请教了他们公司从事病理30多年经验的老师，她告诉我应该如何去分析和解决问题，很快我就找到了思路，结果问题终于解决了。

    具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。***，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6）复染目的是形成细胞轮廓，从而更好对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7）封片为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8）切片清洗为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：⑴单独冲洗，防止交叉反应造成污染。⑵温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；⑶冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。⑷PBS的PH和离子强度的使用和要求。北京多标记免疫组化检测服务

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    ·目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。(2)碱性磷酸酶(AP)及底物·AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：–偶氮偶联反应，底物为-萘酚磷酸盐，经水解后得-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fastblue)或坚牢红(fastred)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。–靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodylphosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法·又分为以下两种方法：–酶标抗体法·直接法·间接法–非标记抗体酶法·酶桥法·PAP法(1)酶标抗体法·通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。–优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。–缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。(1)酶标抗体法——直接法·将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，***用底物显色剂显色。(1)酶标抗体法——间接法·将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合。北京多标记免疫组化检测服务

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