如淋巴细胞表面抗原尤其适合。·组织冻结过程中,北京四色免疫组化染色服务,细胞内、外的水分会形成冰晶,冻结的速度愈慢,北京四色免疫组化染色服务,冰晶颗粒愈大,可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。1、冰冻组织块的常用方法·液氮中冰冻:组织投入液氮中(一196C)中10~20sec;·干冰中加入**(或异戊烷),液体立即气化起泡,温度降至一70C,将组织投入,若在干冰**中置一盛有异戊烷的容器,组织投入该容器内结冻则更好;–上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内,以保护组织。–制成冻块后若需保存,应以铝箔或塑料薄膜封包,贮存于-70C冰箱。2、切片·供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整,并有连续性。·载玻片也应清洁无油污,但一般无需涂抹粘附剂;·切片时,使用恒温冷冻切片机,在箱内温度-25C。切片厚度一般为4~8m。3,北京四色免疫组化染色服务、切片后处理·切好的冰冻切片,室温下自然晾干1~2h后,入4C**固定10min,待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。·冰冻切片由于切片技术要求较高,不易得到连续性很好的切片,其形态结构亦不如石蜡片,且冻块和切片不便于长期贮存,因此冰冻切片的应用受限。
此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。4、几种常用免疫组化方法简单介绍1)免疫荧光方法是**早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理,先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位,进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断、检验中应用较广。2)免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后,于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用,然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,通过光镜或电镜,对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是**常用的技术。该方法与免疫荧光技术相比的主要优点是:定位准确,对比度好,染色标本可长期保存,适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速,已经衍生出了多种标记方法,且随着方法的不断改进和创新,其特异性和灵敏度都在不断提高,使用也越来越方便。
时间过长,会使荧光减弱。·每次试验时,需设置以下三种对照:–阳性对照:阳性血清+荧光标记物–阴性对照:阴性血清+荧光标记物–荧光标记物对照:PBS+荧光标记物间接免疫荧光法的注意事项(续)·标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。·一抗和二抗应始终保持在标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。免疫细胞化学技术免疫酶酶标法【原理】·以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素,沉积于抗原和抗体反应的部位;·酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。1、常用的标记酶及其显色底物·辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)及底物·碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)及底物(1)辣根过氧化物酶(HRP)及底物·HRP是应用**广的一种酶,来源于植物辣根,由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成,分子量约40kDa,稳定性好;·底物为过氧化物和供氢体(DH2)–过氧化物:常用过氧化氢和过氧化氢尿素。–供氢体:多用无色的还原型染料,通过反应生成有色的氧化型染料,**常用的供氢体是DAB。DAB(二氨基联苯胺)·DAB本身无色,反应后呈棕色,不溶于水,不易褪色,电子密度高,**为常用。
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