《2016年浙江省医学会耳鼻咽喉头颈外科学学术年会论文汇编》2016年收藏|手机打开手机客户端打开本文大鼠椭圆囊感觉上皮细胞永生化细胞系的建立刘俊黄海林吴佳源【摘要】：目的通过SV40T抗原在大鼠椭圆囊感觉上皮细胞(utricularsensoryepithelialcell,USEC)表达,建立无限增殖细胞系(USEC-1),为毛***、基因表达及信号转导的研究提供丰富细胞来源。方法取出生1d(postnatalday1,P1)大鼠的椭圆囊感觉上皮,嗜热菌蛋白酶(thermolysin)消化处理,胰酶+胶原酶消化,获得具活性的纯椭圆囊感觉上皮细胞。然后加入猿猴肉瘤***SV40(SimianVirus,SV40)转染培养,通过行态学及增殖能力的变化粗筛出USEC细胞,传代培养。并通过显微镜及透射电镜对细胞的行态，上海Virus法细胞永生化、生长特征观察;细胞角蛋白18、波形蛋白的表达;RT-PCR检测SV40T抗原;细胞计数分析USEC-1细胞的增殖能力;软琼脂糖培养、裸鼠致瘤试验来鉴定永生化细胞系USEC-1的特征。结果USEC-1细胞系保持了原代细胞的表形特征,呈扁平，上海Virus法细胞永生化、多角形、核大而圆的上皮细胞形态，上海Virus法细胞永生化,细胞之间连接紧密,形成单层时呈"铺路石样"外观。可见由成百个SEC-1细胞包绕液体而成的dome。细胞角蛋白表达阳性,波形蛋白表达阴性。不同世代USEC-1均表达SV40T抗原。该系已培养6个月。
virus基因转染法
很多virus转染能够诱导细胞永生化，例如EBvirus(epstein-barr virus, EBV)、猿猴virus40 (simian virus40, SV40)和人**瘤virus(human papillomavirus, HPV)。这些virus转染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。
EBV能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白activate细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。EBV永生化B细胞的一个**明显的特点是端粒酶活性的提高，这可能是导致B细胞永生的主要原因。目前，EBvirus介导的细胞永生化应用**多的是B淋巴细胞，其他细胞中的应用很少。
SV40是简单的真核细胞virus，SV40的T抗原片段是**常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与**相关的转化显型。应用的方法包括：野生型SV40virus共培养转染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录virus载体法等。
细胞永生化端粒酶法
端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖**白酶，由RNA和蛋白质组成。端粒酶能以自身的RNA为模板，从端粒DNA3’-OH 末端延伸端粒或合成新的端粒DNA， 以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持端粒的长度，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。正常情况下，大多数体细胞端粒酶的表达是严格调控的，表达是瞬时和低水平的。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶催化亚基(hTERT)基因能稳定端粒的长度，使细胞易于永生化，因此hTERT的activate是细胞永生化的重要步骤。虽然activate端粒酶活性能够使多种人和动物的细胞永生化，但是对于有些细胞，重建端粒酶活性并不足以使细胞永生化，还需要借助*基因法。
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